磷酸化蛋白组学揭示新型隐球菌的致病原因

景杰编者按：新型隐球菌（Cryptococcus neoformans，以下简称Cn）是导致真菌性脑膜炎的元凶之一。从环境中吸入该类真菌的孢子可直接引发感染，每年在全球范围内导致上百万感染的案例，并且很多都造成了致命后果。因此深入开展Cn侵染宿主的分子病理学研究有助于寻找更加精准的药物靶点，设计生产更为有效的治疗疫苗。前期的研究发现，一些自噬（autophagy）相关蛋白在Cn寄生宿主的过程中起到重要的调控作用，然而目前还没有研究从全局角度分析这一侵染过程中信号通路的变化，因此可能会遗漏很多关键的信息。这篇发表在国际著名期刊Cell Host & Microbe上的文章，通过磷酸化蛋白质组学技术对Cn侵染宿主过程中激酶网络的信号变化进行了全谱分析，发现自噬启动复合体（AIC）和其上游的能量代谢相关激酶LBK1和AMPKα与Cn寄生宿主的过程密切相关。景杰生物作为全球蛋白质及翻译后修饰的领跑者，可以为您提供一整套常规蛋白质组学及磷酸化修饰组学研究的解决方案，同时还能为您提供高灵敏度的修饰类泛抗体，助力您的研究工作。

研究思路和成果：病菌侵染宿主初期所引发的一系列变化对感染进程起决定作用，然而相应的信号调控机制并不清晰。本文中，作者使用抗体调理的（Antibody-opsonized）Cn感染小鼠巨噬细胞2hr，接着通过液质联用技术平台对感染组和未感染组的全蛋白谱和磷酸化谱进行了分析，分别鉴定到了~5300和~5600个磷酸化修饰位点，根据差异变化值定义相应的~1260个蛋白（涵盖~2000个磷酸化位点）与Cn应激相关。生物信息学分析（如氨基酸序列motif分析，蛋白功能聚类STRING分析，代谢通路KEGG分析等）发现在Cn侵染宿主后，mTOR、STK11/LBK1和 AMPK/AIC（自噬启动复合体）信号网络相关蛋白的磷酸化水平发生显著变化，暗示其与感染过程密切相关。

紧接着，研究人员对“Cn感染激活宿主细胞的AMPK-AIC信号网络”这一假设进行了验证。In vitro生化实验结果表明Cn侵染后，LBK1、AMPKα、ULK1、RPS6等的磷酸化水平显著上调，而当在巨噬细胞中敲除AIC相关成分后，自噬过程明显受到抑制，更为重要的是，AMPKα的磷酸化水平显著下调。在原代分离的小鼠脾细胞（ex vivo）以及小鼠体内模型（in vivo）中，研究人员得到了相似的结果，印证了磷酸化组学的数据。

后续功能实验的关键就是要阐明AMPK-AIC信号网络与Cn感染宿主的直接相关性。研究人员发现缺失了AIC组分的巨噬细胞中与Cn侵染相关的吞噬作用和病菌复制过程都受到了抑制。AMPK的激活剂促进了病菌在宿主细胞内的内吞转运和复制过程，相反，AMPK的抑制剂阻碍了这些进程。这些结果证明AMPK-AIC信号网络成分的活性决定了Cn在宿主内的感染程度。

为了进一步探索该研究的意义，作者构建了条件敲除小鼠模型（CKO），特异性的在单核细胞、巨噬细胞、粒细胞等吞噬细胞中敲除AMPKα1（由Prkaa1基因编码）。从Prkaa1-/-小鼠体内分离的髓系巨噬细胞对Cn的侵染有显著的抵抗能力（表现为吞噬作用和病菌复制的减弱），而用AMPK抑制剂处理的正常小鼠髓系巨噬细胞显示出类似的表型，这说明在ex vivo模型中AMPKα的活性推动了Cn侵染宿主的过程。

在动物体内模型中，他们发现AMPK抑制剂处理的小鼠在感染6h后其肺、肝、脾等部位的真菌寄生水平显著低于同样感染的对照组。另一方面，研究人员测定了Prkaa1-/-小鼠在受到Cn侵染6h和14天后其体内病菌感染、组织病变等指标，同样发现了感染程度的减弱。这些结果表明AMPKα的活性是Cn感染所引发的病理结果的驱动因素。

总结：综上所述，该研究通过磷酸化蛋白质组学技术分析了新型隐球菌（Cn）侵染宿主初期激酶网络的变化情况，发现mTOR、STK11/LBK1和 AMPK/AIC信号通路的剧烈变化。通过体内体外模型的功能实验证明AMPK/AIC信号通路是Cn侵染宿主、病菌复制和引发病理变化的驱动因素，不仅为研究真菌与宿主互作机制提供了重要的数据资源，更为相关疾病的治疗寻找到了潜在的药物靶点。

参考文献：

Pandey Aseem, et al., Global Reprogramming of Host Kinase Signaling in Response to Fungal Infection. Cell Host Microbe. 2017 May10;21(5):637-649

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